Avaliação da sensibilidade “in vitro” aos antimicrobianos, de cepas de microrganismos isolados de “swab” cérvico-uterino de fêmeas bovinas e bubalinas do Estado de São Paulo.

GUIDO, M.C¹.; BARUSELLI, P.S²., ZUGE,R.¹.; BENITES, N.R.³, COSTA, E..O.⁴

1 - Pós- Graduanda  Depto Reprodução Animal - FMVZ-USP– mcguido@usp.br

2 – Prof. Doutor Depto. Reprodução Animal – FMVZ-USP

3 - Prof. Doutor Depto Med. Preventiva e Saúde Animal –FMVZ- USP

4 - Profa. Titular Depto. Med. Preventiva e Saúde Animal  - Coordenadora NAPGAMA –  FMVZ -USP

Palavras chaves: Bovino, bubalino, “swab” cérvico-uterino, sensibilidade

Key words; Bovine, Buffalo, cervical uterine  swab, sensibility

Resumo:

A infecção bacteriana do aparelho reprodutivo feminino é um dos fatores que afetam a eficiência reprodutiva de um rebanho, pode ser causa de repetição de cio, anestro, e abortamentos, cervicites, endometrites e metrites.. Neste estudo  foi avaliada a eficiência “in vitro” de alguns antibióticos frente aos microrganismos isolados da região cérvico-uterina de fêmeas bovinas e bubalinas. Foram utilizados 87 fêmeas bubalinas e 77 fêmeas bovinas da raça Holandesa pertencentes a seis propriedades do Estado de São Paulo , sendo três de criação de bovinos leiteiros e três de bubalinos.  As amostras foram colhidas com  auxílio de “swab” estéril, inoculadas em meio Caldo BHI adicionado de vaselina para posterior isolamento de microrganismos anaeróbios e aeróbios. Foram realizados os testes de sensibilidade “in vitro” aos antimicrobianos segundo a técnica de difusão de KIRBY & BAUER. Foi observado maior freqüência de isolamento de microrganismos(p<0,05) em bovinos (77,9%) do que em bubalinos (41,4%). Não foi observada diferença entre a microbiota de fêmeas bovinas e bubalinas (p<0,05), exceto pelo isolamento de bactérias do gênero Streptococcus sp, mais freqüente em bovinos (25,4%) do que em bubalinos (7,9%). A sensibilidade mais alta apresentada pelos microrganismos isolados foi frente a gentamicina, a sensibilidade das cepas variou entre as fazendas de 77,8% a 100,0% . O contrário foi observado com relação à penicilina que variou de 11,1% a 36,4%. O padrão de sensibilidade das cepas bovinas (68,4 ±27,8%) foi em média superior (Teste de Mann Whitney, p<0,05) a sensibilidade das cepas de bubalinos (47,4± 31,8%) Os resultados reforçam o cuidado com o uso indiscriminado de antibióticos nos animais pois, as cepas de microrganismos estão apresentando padrão de resistência elevado até mesmo em espécies como a bubalina menos expostas aos tratamentos aleatórios com antimicrobianos.

Sumary

Infections of bovine and buffaloes female reproductive organs are the causes of several reproductive problems, disturbs like: repeat breeding, fetal envoltory retention, endometritis, metritis, cervicitis and others. In these study were evaluated the in vitro susceptibility of microorganisms isolated from cervical uterine region from bovine females and buffalo females to antibiotics.

77 bovines (Holsteins) and 87 bubaline females kept in six dairy herds in São Paulo State were studied, respectively, three of bovine dairy herds and three of bubaline. Samples of swab have been collected from the cervical uterine region, inoculated in BHI broth medium, and added with vaseline for posterior identification of aerobic and anaerobic microorganisms. The in vitro susceptibility tests to antibmicrobial agents were performed according KIRBY & BAUER diffusion test

 Among the bovines it was verified a higher frequency of bacteria isolation (77.9%) than in bubaline (41.4%) statistically significant difference (p < 0.05).

It was not observed differences between bovine and bubaline microbiota, except for the Streptococcus sp that was isolated in a higher frequency in the bovines (25.4% in bovines and 7.9 % in buffaloes), with a statistically significant difference  (P< 0.05). The highest susceptibility was observed to gentamycin, which ranged from 77.8% to 100.0%, among the herds. The opposite was observed to penicillin, which showed the highest resistance, which ranged from 11.1% to 36.4%. The susceptibility pattern showed by the strains isolated from bovine females (68.4 ± 27.8%) was higher than the susceptibility pattern showed by the strains isolated from the buffalo females (47.4 ± 31.8%) and this difference was statistically significant (test of Mann Whitney p < 0.05). The data supported that the antimicrobials must be used very carefully to avoid the increase of the resistance among the microorganism of microbiota.

Introdução

A eficiência reprodutiva em rebanhos leiteiros é o fator de maior importância para o produtor. O atraso na concepção de uma fêmea leiteira reduz o rendimento e aumenta o custo de produção⁴.

Os processos inflamatórios do sistema genital feminino, particularmente do útero, são muito freqüentes nos animais domésticos.  Iniciam geralmente no endométrio e quase sempre emergem em função  da atividade reprodutiva⁸.

No puerpério, o útero constitui ambiente extremamente favorável ao crescimento de microrganismos. A decomposição de restos das membranas fetais e a presença do lóquio, fazem com que esse órgão torne-se excelente meio de cultura⁸.

A infecção bacteriana se destaca como uma importante causa de repetição de cio, anestro, bem como de abortamentos em bovinos e bubalinos¹⁰.

Segundo COSTA (1995)², alguns microrganismos ubiqüitários considerados apatogênicos ou de baixa patogenicidade, são providos de capacidade abortofasciente, como por exemplo: Streptococcus sp; Staphylococcus sp; Bacillus sp; Pseudomonas spp; Escherichia coli; Corynebacterium spp e Salmonella spp.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a eficiência “in vitro” de alguns antibióticos frente aos microrganismos isolados da região cérvico-uterina de fêmeas bovinas e bubalinas, de acordo com as fazendas avaliadas.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram estudadas 87 fêmeas bubalinas e 77 fêmeas bovinas da raça Holandesa Preto e Branco, as amostras colhidas em seis propriedades do Estado de São Paulo, sendo três de criação de bovinos leiteiros e três de bubalinos.

Foi feita a higienização da vulva e introdução do “swab” a fixado e protegido no aparelho para “swab”b. O aparelho de “swab” era devidamente desmontado, higienizado com álcool e flambado para evitar qualquer tipo de contaminação. O aparelho era revestido por uma camisa sanitáriac com os devidos cuidados, para manter assepsia.

Por palpação retal o aparelho era guiado até os anéis cervicais, onde era rompida a camisa sanitária , exteriorizado o “swab” e rotacionado na entrada dos anéis cervicais (Figuras 1 e 2). Após o que, este era recolhido para o interior do aparelho e retirado da vulva do animal. A camisa sanitária era retirada, o “swab” era desconectado do aparelho e mergulhado em meio caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth) d ,acrescido de vaselina líquida estéril com os devidos cuidados de assepsia, para transporte ao laboratório sob refrigeração.

No laboratório as amostras foram cultivadas em aerobiose e anaerobiose⁷.

As amostras foram semeadas em meio Ágar Brucella e, enriquecido com 5% de sangue de carneiro, vitamina K 10mg/ml e Hemina 5 mg/mlf, em meio Ágar Sabouraud Dextroseg para isolamento de leveduras e fungos e Ágar MacConckeyh para cultivo de bactérias Gram-negativas, foram incubadas na temperatura de 37º C tanto em aerobiose como anaerobiose. Os microrganismos foram identificados e classificados de acordo com metodologia  descrita por MURRAY et al.,1999 ⁷.

Figura 1 – Colheita de material cérvico-uterino de fêmea bovina com auxílio de aparelho para “swab” revestido com camisa sanitária, guiado por palpação retal.

Figura 2 – Colheita de material cérvico-uterino de fêmeas bubalinas com auxílio de aparelho para “swab” revestido com camisa sanitária, guiado por palpação retal.

O teste de sensibilidade “in vitro” aos antimicrobianos foi realizado de acordo com a técnica de BAUER et al.(1966)¹.

Foi realizado o antibiograma em “pool” para cada gênero de microrganismo isolado de cada propriedade.

Os microrganismos foram testados frente aos seguintes antibióticosi:

Para os Gram +:PEN-penicilina (10unid), OXA-oxatetraciclina  (1mcg), TET- tetraciclina (30 mcg), AMO- amoxacilina (10mcg), CLI-clindamicina (2mcg), AMP-ampicilina (10mcg), ERI-eritromicina (15mcg), SUT-sulfazotrin (25mcg), GEN-gentamicina (10mcg), CFO - cefoxitina (30mcg).

Para os Gram - : TE-tetraciclina (30mcg), CM-cloranfenicol (), netilmicina (NT), carbenecilina (CA), gentamicina (GE),  amicacina (AK),  polimixina B (PO), tobramicina (TO),  ampicilina (AM), cefalotina (CF), cefoxitina (CX), sulfazotrim (ST).

A análise estatística foi realizada, utilizando-se o “Software” GRAPHPAD INSTAT (1990-1993)⁵. Para avaliar porcentagem de isolamento foi utilizado Teste de Fisher e para comparar os padrões de sensibilidade, teste de Mann Whitney. Foi adotado P < 0,05 para todos os testes.

RESULTADOS

No presente estudo obteve-se  isolamento  de microrganismos dos “swabs” cérvico-uterino em 77,9 % dos bovinos e em 41,4% dos bubalinos, tais resultados  apresentaram diferença estatisticamente significante (Teste de Fisher, p<0,05).(Tabela 1).

Na Tabela 2, pode-se observar que em bubalinos houve  predominância de isolamento de  bactérias do tipo Staphylococcus  coagulase negativo (39,5%), seguido por  Bacillus sp (31,6%), Corynebacterium sp (10,5%), Streptococcus sp (7,9%), enterobactérias (5,3%) e outros (5,3%).Em bovinos houve prevalência de Streptococcus  sp e Bacillus sp (25,4%), seguidos por Staphylococcus  coagulase negativo (20,6%), enterobactérias (19,0%) , Corynebacterium  sp (10,5%) e outros (4,8%).

Dentre os microrganismos encontrados em bovinos, obteve-se  isolamento de levedura (Candida spp) e fungos miscelianos do tipo Aspergillus fumigatus, o mesmo não foi observado em bubalinos (Tabela 3).

Quando comparados os tipos de microrganismos isolados de bovinos e bubalinos (25,4% para bovinos e 7,9% para bubalinos), observou-se diferença estatisticamente significante somente para as bactérias do gênero Streptococcus  sp, que foram mais freqüentemente isoladas em amostras de  bovinos (Teste de Fisher, p<0,05)

As porcentagens de sensibilidade das cepas isoladas das 5 fazendas frente à gentamicina variaram de um mínimo de 77,8% ao máximo de 100,0% , sendo o antibiótico, com a média mais alta de sensibilidade frente aos microrganismos testados.O contrário foi observado em relação à penicilina que variou de 11,1% a 36,4% (Tabela 4). A média de sensibilidade apresentada pelas cepas estudadas frente a gentamicina (87,5 ±9,3%) foi estatisticamente superior à observada frente à penicilina (19.8 ±12,7%) (Teste de Mann Whitney p<0,05).

As amostras de microrganismos isolados dos animais das diferentes propriedades apresentaram padrões diversos de sensibilidade frente aos antimicrobianos testados.

As amostras isoladas de bubalinos apresentaram sensibilidade média por fazenda de 47,5 ± 30,6%; na fazenda nº 1; 47,4 ± 34,5% na fazenda nº 2; e para bovinos, foi de 62,1 ± 25,9%, na fazenda nº 4; 67,0 ± 36,4% na fazenda nº 5 e 76,0  ± 19,6 %  na fazenda nº 6.

A média  de sensibilidade das amostras de bubalinos foi de 47,4 ± 31,8 % e para bovinos foi de 68,4 ± 27,8 %. O padrão de sensibilidade das cepas bovinas foi em média superior à sensibilidade das cepas de bubalinos (Teste de Mann Whitney, p<0,05).

TABELA 1 – Porcentagem    de     isolamento     de     microrganismos a partir de “swab” cérvico-uterino   de  bubalinos e  bovinos leiteiros, São Paulo, 2000.

 ^a,b Diferem estatisticamente (Teste de Fisher, p< 0,05)

TABELA 2 -    Gêneros  de    microrganismos mais freqüentes isolados de amostras de material cérvico-uterino de bubalinos e bovinos leiteiros, São Paulo, 2000.

^a,b Diferem estatisticamente (Teste de Fisher, p<0,05)

TABELA 3 –Identificação   dos   microrganismos isolados de amostras de material cérvico-uterino de bubalinos e bovinos leiteiros, São Paulo, 2000.

TABELA 4 – Resultados dos testes de sensibilidade "in vitro" aos antimicrobianos apresentados pelos microrganismos   prevalentes isolados de amostras de material cérvico-uterino  de bubalinos e bovinos leiteiros em 5 fazendas  do Estado de São Paulo, 2000.

Pen - Penicilina (10unid), oxa – Oxacilina (1mcg), Tet – Tetraciclina (30 mcg)Amo – Amoxacilina (10mcg), Cli – Clindamicina (2mcg), Cfl – Cefalotina (30mcg), Amp – Ampicilina (10 mcg) , Eri - Eritromicina (15 mcg), Sut – Sulfazotrim (25 mcg), Gen – Gentamicina (10 mcg) , Cfo – Cefoxitina (30 mcg)

DISCUSSÃO

No presente estudo, houve maior isolamento de microrganismos das amostras cérvico-uterinas de bovinos (77,9%) do que de bubalinos (41,4%). Frente a estes resultados poder-se-ia inferir estarem os bovinos mais expostos às infecções.

O padrão de sensibilidade das cepas bovinas (68,4 ± 27,8%. %) foi em média superior à sensibilidade das cepas de bubalinos (47,4 ± 31,8), sendo esta diferença estatisticamente significante. Este resultado difere do esperado, uma vez que o uso indiscriminado de antimicrobianos aparentemente é mais freqüente em bovinos, particularmente bovinos leiteiros, o que vem determinando altos níveis de resistência em cepas de microrganismos isolados de diversos processos infecciosos desses animais.^3,6

As porcentagens de sensibilidade das cepas isoladas das 5 fazendas frente à gentamicina, variaram de 77,8% a 100,0% , sendo o antibiótico com a média mais alta de sensibilidade frente aos microrganismos testados. O contrário foi observado em relação à penicilina (Tabela 4). A média de sensibilidade apresentada pelas cepas estudadas frente à gentamicina (87,5 ±1%) foi estatisticamente superior à observada frente à penicilina (19,8 ± 12,7%).

KRISHNAN et al. (1994)⁶ encontraram em amostras isoladas de vacas com repetição de cio 92% de sensibilidade à gentamicina, enquanto que à penicilina 44% das amostras foram sensíveis. VERMA et al. (1994)¹¹ trabalharam com muco cervical de vacas normais, e com  animais com descarga uterina e verificaram que a maioria das amostras isoladas eram sensíveis à gentamicina 96,23%, sendo baixa a sensibilidade à penicilina 3,57% , DHOLAKIA et al. (1987)³ trabalhando com amostras de muco cervical de bubalinos e bovinos, encontraram sensibilidade à gentamicina de 66,57%, enquanto que à  penicilina foi de 20,26%, dados semelhantes ao observado no presente trabalho.

Com relação ainda à sensibilidade “in vitro” aos antimicrobianos,  entre os autores brasileiros, OBA et al. (1994)⁹ , observaram que os antimicrobianos mais eficientes foram: para Corynebacterium sp , Cloranfenicol (96,0%), Ampicilina (88%), Gentamicina (88,%); para Staphylococcus sp, Gentamicina (93,3%), Cloranfenicol (83,3%); para Streptococcus a  hemolítico, Cloranfenicol (93,7%); para Streptococcus b hemolítico Cloranfenicol (95%), Ampicilina (91,0%); para Escherichia coli  Gentamicina (80,0%). Os resultados destes autores em relação à gentamicina também estão condizentes com os obtidos neste estudo.

CONCLUSÃO

  Deve-se ter cuidado com o uso indiscriminado de antibióticos nos animais pois, até espécies como a bubalina  menos exposta aos  tratamentos aleatórios estão apresentando cepas de microrganismos bastante resistentes aos antibióticos de uso mais comum, determinando maior dificuldade no tratamento de afecções causadas por estes microrganismos.

REFERENCIA BIBLIOGRÁFICA

1.      BAUER, A.W.; KIRBY, W.M.; SHERRIS, J.C.; TURCK, M. Antibiotic susceptibility tetsting by a standardized single disk method. American Journal Clinical Pathology. v.45, p.493-6, 1966.         

2.      COSTA, E.O. Abortamentos Infecciosos de Bovinos In: CONGRESSO BRASILEIRO DE REPRODUÇÃO ANIMAL, 11., Belo  Horizonte, 1995.  Anais. p.71-9.

3.      DHOLAKIA, P.M.; SHAH, N.M.; PUROHIT, J.H.; KILER, H.N. Bacteriological study on non-specific genital infection and its antibiotic spectra in repeat breeders. Indian Veterinary Journal, v.64, p.637-40, 1987

4.      FERREIRA, A.M.; SÁ, W.F. Estudo das infecções uterinas em vacas leiteiras. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v.23, n.3, p.339-44, 1987.

5.      GRAPHPAD INSTAT - (1990-1993) - “Software” utilizado para realizar a análise estatística.

6.      KRISHNAN, R.; TANWANI, S.K.; MAGHE, M.N. Antibiotic Sensitivity Pattern of Bacteria Isolated from Repeat Breeding and normal cows. Indian Veterinary Jornal, v.71, p.315-17, 1994

7.      MURRAY, P.R.; BARON, E.J.; PFALLER, M.A.; TENOVER, F.C.; YOLKEN,R.H. Manual of clínical microbiology, 7 ed., Washington, D.C., American Society for Microbiology, 1999.

8.      NASCIMENTO, E.F.; ABDO, M.A.G.S.; CHQULOFF, M.A.G.; CASSALI, G.D. Alterações Morfológicas em ovários e útero de vacas azebuadas não gestantes. I. Alterações inflamatórias: metrite, endometrite e cervicite. Arquivo Brasileiro de Medicina Vetrinária e Zootecnia, v.46, n.2, p.121-6, 1994

9.      OBA, E.; LANGONI, H.; PAULA SANTOS, M.A.F.; LISTONI, F.; EMILIO, J.; PIMENTEL, M.A. Estudo bacteriológico e sensibilidade dos microorganismos isolados da vagina de búfalas face a diferentes drogas antimicrobianas. Revista Brasileira de Reprodução Animal, v.18, n.1-2, p.47-54,1994.

10.  ROBERTS, S.J. (THERIOGENOLOGY) Veterinary obstetrics and genital diseases. Michigan:  Edward Brothers, 1986. 776p.

11.  VERMA, H.K.; SHARMA, D.K.; KAUR, H.; DABLANIA, D.C. A bacteriologocal  study of repeat breeder cows and their treatment.  Indian  Journal Dairy Sciency, v.47, n.6, p.467-70, 1994.

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